T5核酸外切酶試劑，它可降解雙鏈DNA、單鏈DNA和缺刻的質(zhì)粒DNA。它既能從5’-末端起始降解DNA，也能從線性或環(huán)狀雙鏈DNA的切刻或缺口處起始降解DNA，但不能降解超螺旋雙鏈DNA。基于以上特性，T5核酸外切酶可應(yīng)用于Gibson組裝。

單位定義

1單位指在50μl反應(yīng)體系，37℃條件下，30分鐘內(nèi)能從雙鏈DNA底物上催化產(chǎn)生1nmol的酸可溶性脫氧核糖核苷酸所需要的酶量。

組分

名稱數(shù)量

T5 Exonuclease (10U/μl)100μl

10×T5 Exo Buffer1ml

儲存

置于-20°C，可保存3年。

使用注意事項

（1）1× T5 Exo Buffer：50mM KAc，20mM Tris-Ac pH 7.9，10mM Mg(Ac)2，1mM DTT。該酶在PCR Buffer中也具有活性。

（2）該酶的最佳反應(yīng)溫度為37°C，在50°C也具有一定活性，因此可用于Gibson組裝。

T5核酸外切酶試劑恒溫擴(kuò)增使用策略及實例展示

應(yīng)用實例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測結(jié)果，可以看到檢測反應(yīng)<20min(達(dá)平臺期)。

應(yīng)用實例2： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測試。OG變色法為終點變色策略，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，溶解管蓋上染料后，陽性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測結(jié)果。

應(yīng)用實例3：A3825-01 紅黃變色反應(yīng)（肉眼觀察）

以 體外轉(zhuǎn)錄 RNA 為模板，1-6分別為1、10 、100、1000、104和106Copy，NTC為ddH2O為模板。 上圖為加樣結(jié)束反應(yīng)起

始前，下圖為 65 度反應(yīng) 30min 后。

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